PRESENTEE POUR L’OBTENTION DU DIPLOME DE DOCTORAT EN SCIENCES

Abstract

يركز بحثنا على دراسة نشاط مضادات الاكسدة و الوقاية العصبية لمستخلصات المائية و الميتانولية لجدور عاقر قرحة Anacyclus pyrethrum L. و اوراق Artemisia absinthium L. و Urtica urens L. المستخدمة في الطب التقليدي .

يكشف التقدير الكمي للفينولات الكلية بواسطة طريقة Folin-Ciocalteu L. و الفلافونويدات بواسطة تقنية كلوريد الالمنيوم عن محتوى الفينولات الكلية ما بين 12,33 ± 5,85 و 36,66 ± 5,25 ميكروغرام مكافئ حمض الغاليك | ميليغرام من المستخلص النباتي. توجد اعلى كمية من الفينولات الكلية في المستخلصات الميتانولية للنباتات الثلاثة . يتراوح محتوى الفلافونويدات المعبر عنه بمكافئ الكرستين من 0,49 ± 0,088 الى 28,91 ± 2,34 ميكروغرام مكافئ الكرستين | ميليغرام من المستخلص النباتي . كانت كمية الفلافونويدات اعلى ايضا في المستخلصات الكحولية باستثناء Anacyclus pyrethrum L. حيث يحتوي المستخلص المائي على محتوى الفلافونويدات اعلى بكثير (p˂0.001).

يتم تقيم نشاط مضادات الاكسدة للمستخلصات الستة بطريقتين مختلفتين . الاولى باستعمال الجذر الحر DPPH. تم تحديد التركيزات التي ادت الى تثبيط 50% من هذا الجدر الحر المعبر عنها بIC50 . اظهرت المستخلصات المائية و الميثانولية الستة للنباتات الثلاث نشاطا مضادا للجدور الحرة ، المستخلصات اظهرت نشاطا جذريا في الكسح بالتناسب مع التركيزات التي تم اختبارها. الطريقة الثانية لتقيم نشاط مضادات الاكسدت هي طريقة قدرة الارجاع حيث اظهرت المستخلصات قوة الارجاع تتناسب مع تركيزاتها .

تم اختبار سمية المستخلصات المائية و الميتانولية للنباتات الثلاث على خلايا دماغية CAD بواسطة اختبار الحيوية الخلوية (MTT) . تركيزات من0,1 الى 0,0001 ميليغرام | ميليلتر من المستخلص المائي و الميتانولي ل Artemisia absinthium L. و Anacyclus pyrethrum L. ليس لها اي تاثير سام على الخلايا الدماغية CAD . في النوع Urtica urens L. تركيزات من 0.1 الى 1 ميليغرام | ميليلتر من المستخلص المائي و الميتانولي لم يكن لها اي سمية على خلايا CAD . تمت كذلك دراسة اثار بيروكسيد الهيدروجين على خلايا CAD حيث لوحظ وجود حماية عصبية واضحة (p˂0.01) بالمستخلص المائي لجذور Anacyclus pyrethrum L. بتركيز 0.1 ميليغرام | ميليلتر في حين ان التركيز 0.01 ميليغرام | ميليلتر لم يكن له اي تاثير على هذه الخلايا . من ناحية اخرى ، المستخلصات المائية و الميتانولية ل Artemisia absinthium L. و Urtica urens L. لم تظهر اي حماية عصبية على خلايا CAD المعالجة ببيروكسيد الهيدروجين.

تولد ايونات Ca2+ داخل الخلايا عدد كبيرا من الاشارات التي تتحكم في الوضائف الرئيسية للخلايا العصبية لكن اي خلل يحدث في تركيز الكالسيوم الخلوي يمكن ان يكون حاسما بالنسبة لهذه الخلايا يمكن ان يادي بها الى الموت . اذا استطاعت المستخلصات النباتية ان تمنع الزيادة المفرطة للكالسيوم في الخلايا العصية عن طريق دخوله عبر قنوات الكالسيوم ، فان هذا من شانه ان يساهم في العمل الوقائي لهذا المستخلص . في هذا الاتجاه تم توجيه دراستنا و دراسة تاثير المستخلصات المائية و الميتانولية للانوع الثلاث على تركيزات الكالسيوم في الخلايا العصبية CAD قبل و بعد الاستقطاب بKCl .على عكس المستخلص الميثانولي ل Anacyclus pyrethrum L. الذي قمع بشكل كبير الاستجابة للاستقطاب ، المستخلص المائي مدد هذه الاخيرة . المستخلصات المائية و الميتانولية ل Artemisia absinthium L. الغت تماما الاستجابة للاستقطاب مقارنتا مع الشاهد ، اما المستخلصات المائية و الميتانولية ل Urtica urens L. قللت بشكل كبير من الاستجابة للاستقطاب الناجمة عن KC ****************************************************************************************************************************************** Notre travail de recherche porte sur l’étude de l’activité antioxydante et neuroprotectrice des extraits aqueux et méthanoliques des racines de Anacyclus pyrethrum L. et des feuilles de Artemisia absinthium L. et de Urtica urens L. utilisés en médecine traditionnelle. La quantification des phénols totaux par la méthode du Folin-Ciocalteu et des flavonoïdes par la technique du trichlorure d’aluminium, révèle le contenu en polyphénols compris entre 12,33 ± 5,85 et 36,66 ± 5,25 µg EAG/mg d’extrait. La quantité des polyphénols la plus élevée est présente dans les extraits méthanoliques des trois plantes. Les teneures en flavonoïdes exprimées en équivalent de quercétine sont de l’ordre de 0,49 ± 0,088 à 28,91 ± 2,34 µg EQ/mg d’extrait. La quantité des flavonoïdes été aussi plus élevée dans les extraits alcooliques sauf pour A. pyrethrum L. où l’extrait aqueux contenait une teneur en flavonoïdes nettement plus élevée (p˂0.001). L’activité antioxydante des six extraits est évaluée par deux méthodes différentes. La première est celle du radical libre DPPH. Les concentrations ayant conduit à une inhibition de 50% de ce radical sont désignées par l’IC50. Les six extraits aqueux et méthanoliques des trois plantes ont montré une activité anti-radicalaire ; les extraits ont exhibé une activité de piégeage du radical de façon proportionnelle avec les concentrations testées. La deuxième méthode d’évaluation de l’activité antioxydante est celle du pouvoir réducteur. Les six extraits ont révélé un pouvoir réducteur proportionnel à leurs concentrations. La toxicité des extraits aqueux et méthanoliques de A. pyrethrum L., A. absinthium L. et U. urens L. a été testée sur des cellules CAD par le test de viabilité cellulaire (MTT). Des concentrations de 0,1 à 0,0001 mg/ml d'extrait aqueux et méthanolique de A. pyrethrum L. et de A. absinthium L. n'ont induit aucun effet neurotoxique sur les cellules CAD. Chez l’espèce Urtica urens L., à des concentrations de 0.1 à 1 mg/ml d'extrait méthanolique et aqueux, aucune neurotoxicité n’a été observée chez les cellules CAD (p>0.05). Les effets du peroxyde d'hydrogène sur les cellules CAD ont été étudiés. Un effet neuroprotecteur clair (p˂0.01) a été observé avec l’extrait aqueux des racines de A. pyrethrum L. à la concentration de 0.1mg/ml, en revanche aucun effet de cet extrait n’a été remarqué à la concentration de 0.01mg/ml. Par ailleurs, les extraits aqueux et méthanoliques des feuilles de A. absinthium L. et de U. urens L. n’ont montré aucun effet neuroprotecteur (p>0.05) sur les cellules CAD traitées au peroxyde d’hydrogène. Les ions Ca2+ génèrent une multitude de signaux intracellulaires qui contrôlent des fonctions clés dans les neurones mais une dyshoméostasie calcique peut être décisive pour ces cellules allant jusqu’à leur mort. Par conséquent si, à la suite d’une dépolarisation ou tout autre stimuli, un extrait végétale empêcherait l'augmentation excessive de la [Ca2+]i dans les neurones par son entrée à travers les canaux calciques, cela contribuerait à l'action neuroprotectrice de cet extrait. C’est dans ce sens que notre étude a été dirigée et l'effet des extraits aqueux et méthanoliques des racines de Anacyclus pyrethrum L., des feuilles de Arthemesia absinthium L. et de Urtica urens L., sur les concentrations intracellulaires de Ca2+ libre des cellules neuronales cultivées de souris CAD, avant et durant la dépolarisation au KCl, a été enregistré. Contrairement à l'extrait méthanolique de A. pyrethrum L. qui a significativement supprimé la réponse à la dépolarisation, l'extrait aqueux semble étendre cette dernière. Les extraits aqueux et méthanoliques de A. absinthium L. (0.1mg/ml) ont complètement supprimé la réponse à la dépolarisation induite par le KCl, par rapport au contrôle. Cependant, l'extrait aqueux et méthanolique de U. urens L. (0,1 mg/ml) ont fortement réduit la réponse à la dépolarisation induite par le KCl par rapport au contrôle. L'analyse haute résolution LC-UV-MS/MS a révélé la détection des différentes classes de composés dans les extraits aqueux et méthanoliques de A. pyrethrum L. entre autre les acides caféoylquiniques, la N-feruloyltyramine et les alcaloïdes ************************************************************************************************************************************************** Our research focuses on the study of antioxidant and neuroprotective activity of aqueous and methanolic extracts of the roots of Anacyclus pyrethrum L. and leaves of Artemisia absinthium L. and Urtica urens L. used in traditional medicine. The quantification of total phenols by the Folin-Ciocalteu method and flavonoids by the aluminium trichloride technique reveals the polyphenol content between 12.33 ± 5.85 and 36.66 ± 5.25 μg EAG/mg of extract. The highest amount of polyphenols is present in the methanolic extracts of the three plants. The flavonoids content expressed as quercetin equivalents are of the order of 0.49 ± 0.088 to 28.91 ± 2.34 μg EQ/mg of extract. The amount of flavonoids was also higher in alcoholic extracts except for A. pyrethrum L. where the aqueous extract contained significantly higher flavonoids content (p˂0.001). The antioxidant activity of the six extracts is evaluated by two different methods. The first is that of the free radical DPPH. The concentrations which led to a 50% inhibition of this radical are designated IC50. The six aqueous and methanolic extracts of the three plants showed anti-radical activity; the extracts exhibited a radical scavenging activity proportionally with the concentrations tested. The second method of evaluating the antioxidant activity is that of the reducing power. The six extracts revealed a reducing power proportional to their concentrations. The toxicity of aqueous and methanolic extracts of A. pyrethrum, A. absinthium L. and U. urens L. was tested on CAD cells by the Cell Viability Test (MTT). Concentrations of 0.1 to 0.0001 mg / ml aqueous and methanolic extract of A. pyrethrum L. and A. absinthium L. did not induce any neurotoxic effect on CAD cells. In the U. urens L. species, at concentrations of 0.1 to 1 mg/ml of methanolic and aqueous extract, no neurotoxicity was observed in CAD cells (p> 0.05). The effects of hydrogen peroxide on CAD cells have been studied. A clear neuroprotective effect (p˂0.01) was observed with aqueous A. pyrethrum L. root extract. At the concentration of 0.1mg/ml, however no effect of this extract was observed at the concentration of 0.01mg/ml. On the other hand, the aqueous and methanolic extracts of A. absinthium L. and U. urens L. showed no neuroprotective effect (p> 0.05) on hydrogen peroxide-treated CAD cells. Ca2+ ions generate a multitude of intracellular signals that control key functions in neurons but calcium dyshomeostasie can be decisive for these cells until they die. Therefore, as a result of depolarization or any other stimuli, a plant extract would prevent the excessive increase of [Ca2+]i in neurons by its entry through the calcium channels, this would contribute to the neuroprotective action of this extract. In this sense our study was directed to the effect of aqueous and methanolic extracts of Anacyclus pyrethrum’s roots, Arthemesia absinthium’s and Urtica urens’s leaves, on the intracellular concentrations of free Ca2+ of neuronal cells. CAD mouse cultures before and during KCl depolarization were recorded. Unlike, the methanolic extract of A. pyrethrum which significantly suppressed the response under depolarization. The aqueous extract seems to extend the latter. Aqueous and methanolic extracts of A. Absinthium L. (0.1mg/ml) completely decreased the response to KCl-induced depolarization compared to control. However, the aqueous and methanolic extract of U. urens L. (0.1 mg/ml) significantly reduced the response to KCl-induced depolarization compared to control. High-resolution analysis LC-UV-MS/MS revealed the detection of the different classes of compounds in the aqueous and methanolic extracts of A. pyrethrum L. among others the cafoylquinic acids, the N-feruloyltyramine and the alkaloids