Etude des Lactobacillus vaginaux : Identification, effets protecteurs, facteurs de déséquilibre et moyens de régénérescence

Abstract

ملخص تعتبر الفلورا الطبيعية عنصرا هاما في المحافظة على صحة الإنسان. فمنذ أن وصف العالم Doderlein بكتيريا حمض اللاكتيك المهبلية و الدراسات حول طبيعتها المعقدة وترابطها مع عناصر أخرى من المضيف تتزايد بشكل كبير. وقد أدت الاستخدامات المتعددة للمضادات الحيوية ومنتجات الاستحمام المهبلية وعوامل أخرى فيزيائية وهرمونية ومرضية إلى الإضرار بهذه الفلورا وبالتالي ظهور التهابات تناسلية مختلفة. ومع تزايد الصعوبات في علاج هذه الالتهابات توجه البحث إلى تفعيل دور بكتيريا حمض اللاكتيك المهبلية لاستخدامها كبروبيوتيك إما للوقاية أو للعلاج تزامنا مع العلاجات المعتادة. قمنا في هذه الدراسة بعزل سبع وثلاثين بكتيريا تابعة للجنس Lactobacillus أخذت من واحد وأربعين امرأة سليمة. حددت هذه العزلات بطرق مظهرية ووراثية وتم اختيار ثلاثة وعشرين منها لأجراء اختبار التضاد مع أربعة ميكروبات ممرضة للجهاز التناسلي البولي وأيضا للكشف عن إنتاجها لحمض اللاكتيك وبيروكسيد الهيدروجين، والبكتريوسينات وتشكيلها للبيوفيلم. كما اختبرت في هذه الدراسة أيضا مجموعة من المضادات الحيوية ومنتجات الاستحمام المهبلية لمعرفة تأثيرها على تسعة عزلات التي لها قدرة على تضاد كل الميكروبات الممرضة المدروسة. أظهرت نتائج ال PCR باستعمال بادئات خاصة بالجنس ثم بادئات خاصة بالمجوعة وأخرى بالنوع أن السبعة و الثلاثين عزلة تنتمي إلى الجنس Lactobacillus وإلى المجوعة IV وموزعة على النوعيين L. reuteri و L. salivarius . يشير اختبار التضاد أن 39,13% من عزلات Lactobacillus تملك القدرة على تضاد الميكروبات الممرضة المدروسة. وأن الأس الهيدروجيني ) pH ( الناجم عن هذه العزلات تراوح بين 4,07 و 4,60 و أن العزلة 22L أنتجت اكبر كمية من حمض اللاكتيك بحموضة قدرت نسبتها ب 1,59% . تبين من خلال هذه الدراسة أن ثلاث عزلات فقط تنتج 2O2H بكميات قليلة. بينت نتائج تثبيط الميكروبات الممرضة برشاحات مأخوذة من العزلات L20, L19g, L15, L12, L10, L7 بعد إزالة التأثيرات المفترضة من حمض اللاكتيك و 2O2H احتمال احتواء هذه الرشاحات على مواد بروتينية هي إما بكتريوسينات أو أشباه بكتريوسينات. أشارت النتائج أيضا أن العزلات التسعة كانت حساسة للمضادات الحيوية TE, E, P, CD و C و مقاومة ل Met, VA و K وأن منتجات الاستحمام الثلاثة أظهرت أدنى تراكيز مثبطة للعزلات بين 1,5 - 0,09 % بالإضافة إلى قدرات عزلات Lactobacillus المتفاوتة في تشكيل البيوفيلم. بناءا على النتائج المتحصل عليها، يمكن القول أن بكتيريا حمض اللاكتيك المهبلية المدروسة أظهرت تأثيرات حيوية تجعل استخدامها في تجديد الفلورا المهبلية ممكنا، شريطة المزيد من دراسات أخرى أكثر تعقيدا وبطرق عالية التقنين لاختيار منها ما يصلح لاستعماله في هذا التجديد قبل الدخول في الدراسات السريرية. الكلمات الدالة: Lactobacillus ، التضاد، حمض اللاكتيك، 2O2H ، البكتريوسينات، بيوفيلم، مضادات حيوية، منتجات الاستحمام المهبلية. Résumé : Le microbiote joue un rôle important dans le maintien de la santé humaine. Depuis la description de Doderlein, les études visant à déterminer la nature complexe de la flore vaginale et leurs interrelations avec d'autres membres de l'hôte ont proliféré énormément. L’utilisation de différents antibiotiques et des produits de douche vaginaux, en plus d’autres facteurs physiques, hormonaux et pathologiques favorise l’apparition de multiples infections génitales. L'incidence élevée des traitements non réussis et de récidives rapides ont redirigé l’objet de la recherche sur la flore vaginale, car elle pourrait être utilisée comme probiotiques soit seule soit en combinaison avec des traitements conventionnels. Trente-sept isolats de lactobacilles ont été prélevés auprès de quarante et une femmes saines et identifiés par des méthodes phénotypiques et génotypiques. Vingt-trois isolats ont subi un test d’antagonisme vis-à-vis de quatre germes responsables d’infections uro-génitales. La détection de la production d’acide lactique, de peroxyde d'hydrogène, des bactériocines et la formation de biofilm ont été étudiées chez les isolats de ce groupe. Neuf isolats seulement montrant un large spectre d'activité antimicrobienne, ont été testés pour leur susceptibilité contre certains agents antibiotiques et antiseptiques. Les résultats de la PCR par des amorces spécifiques au genre, aux groupes et aux espèces montrent que les 37 isolats sont affiliés au groupe IV du genre Lactobacillus et répartis en deux espèces L. reuteri et L. salivarius. Le test d’antagonisme indique que 39,13% de Lactobacillus vaginal étudiés possèdent un potentiel antimicrobien. Le niveau de pH induit par les isolats de lactobacilles variait de 4,07 à 4,60. L’isolat L22 produisait la plus grande quantité d'acide lactique avec une acidité titrable de 1,59%. Seulement trois isolats ont été mis en évidence pour produire le H2O2 en faibles quantités. L'activité des surnageants des isolats L7, L10, L12, L15, L19g et L20 après élimination des effets putatifs de l'acide lactique et H2O2 a soulevé la question pour une éventuelle production de substances protéiques (bactériocines ou bacteriocin-like). En outre, les isolats de lactobacilles ont montré des capacités variables dans la formation de biofilm. Neuf de ces lactobacilles testés étaient sensibles aux antibiotiques TE, E, P, CD et C et résistants à Met, VA et K, ils ont présenté aussi un effet inhibiteur avec une CMI allant de 1,5 à 0,09% par les trois produits de douche étudiés. Les lactobacilles caractérisés dans notre étude montrent un potentiel probiotique qui pourrait être utilisé dans la régénérescence du microbiote vaginal. Des études plus complexes basées sur des méthodes hautement standardisées pour les sélectionner comme probiotiques vaginaux sont nécessaires, avant d'entrer au stade des études cliniques. Mots clés : Lactobacilles vaginaux, activité antimicrobienne, acide lactique, H2O2, bactériocine, biofilm, antibiotiques, produits de douches vaginales. Abstract The microbiota plays a significant role in maintaining human health. Since the description of Doderlein, studies to elucidate the complex nature of vaginal flora and their interrelations with other members of the host proliferated tremendously. The use of various antibiotics and vaginal douche products in addition to other physical, hormonal and pathological factors promotes the development of multiple genital infections. High incidence of unsuccesful treatments and rapid recurrences re-directed the focus of research into vaginal flora as it might be used as a probiotic either alone or in combination with conventional therapies. Thirty-seven lactobacilli isolates were collected from forty-one healthy women identified by phenotypic and genotypic methods. Twenty-three isolates were tested for antagonism against four germs responsible for urogenital infections. The detection of lactic acid, hydrogen peroxide, bacteriocins production and biofilm formation were studied. Nine isolates showing a broad spectrum of antimicrobial were tested for their susceptibility to certain antibiotic and antiseptic agents. The results of the PCR by primers specific to the genus, groups and species show that the 37 isolates belong to group IV of the genus Lactobacillus and are divided into two species L.reuteri and L.salivarius. The antagonism test indicated that 39.13% of the vaginal Lactobacillus studied had an antimicrobial potential. The pH level induced by Lactobacillus isolates ranged from 4.07 to 4.60. The L22 isolate produced the highest amount of lactic acid with a titratable acidity of 1.59%. Only three isolates were evidenced to produce the H2O2 in weak amounts.The supernatants activity of the isolates L7, L10, L12, L15, L19g and L20 after elimination of the putative effects of lactic acid and H2O2, raised the question for a possible production of proteinous substances (bacteriocin or bacteriocin-like). In addition, lactobacilli isolates showed varying capacities in biofilm formation.The nine lactobacilli tested were sensitive to antibiotics TE, E, P, CD and C and resistant to Met, VA and K, they also exhibited an inhibitory effect with a MIC ranging from 1.5 to 0.09% by the three douche products studied. The lactobacilli characterized in our study show a significant probiotic potential which could be used in the regeneration of the vaginal microbiota. More complex studies based on highly standardized methods to select them as vaginal probiotics are needed before entering the stage of clinical studies. Key words: Vaginal lactobacilli, antimicrobial activity, lactic acid, H2O2, bacteriocin, biofilm, antibiotics, vaginal douche products.