Effet des composés naturels sur l’adhérence et la formation de biofilm à Pseudomonas aeruginosa

Abstract

الملخص توفر طريقة الحياة في البيوفيلم للبكترياP. aeruginosa بيئة كثيفة و واقية من المضادات الحيوية والجهاز المناعي للمضيف، مما يجعل علاج عدوى هذه البكتريا أكتر تعقيدا ويتطلب البحث عن علاجات جديدة. في هذا الإطار قمنا بدراسة النشاط المضاد للبكتيريا والتأثير على تشكيل البيوفيلم بمستخلصات، تم الحصول عليها من ثلاثة نباتات وهي: الثوم (Allium sativum) وأوراق نوعين من الحناء (Lawsonia inermis) وأوراق نبات الخوخ (Prunus persica). مستخدمين في ذلك ستة عزلات سريرية لــ P. aeruginosa وسلالة مرجعيةP. aeruginosa ATCC 27853. تم اختبار تشكيل البيوفيلم على نمطين من الدعامات وفي وسطين هما تريبتكاز الصويا ومرق البيوفيلم المعدل. أثبتت هذه الدراسة أن كمية البيوفيلم التي تشكلها P. aeruginosa تعتمد على السلالة البكترية نفسها وعلى الوسط المغذي ونمط الدعامة التي تتثبت عليها البكتريا. كما لوحظ أن مردود مركبات متعددة الفينول و الفلافونويدات تتعلق بالنبات المستعمل و بنوع المذيب المستخدم في الاستخلاص، حيث وجد أن مستخلص أسيتات الإثيل للحناء L. inermis أظهر كميات أعلى من متعددة الفينول تقدر بـmg EAG/g 224,83 ± 20,07 و mg EAG/g244,58 ± 25,54 لأوراق الحناء من منطقة أدرار ومنطقة بسكرة على التوالي. إن قيم التركيز المثبط الأدنى (CMI) التي سجلت بالمستخلصات المدروسة تتراوح من 3,15 إلى6,25 ٪ (v/v) لمستخلص الثوم و ml /3,15mg إلىml /mg 12.5 لمستخلصات أسيتات الإثيل و البيتانول لنوعي inermis L. وml/20 mg إلى ml /mg 25 لمستخلصات P. persica . وقد انخفض تشكيل البيوفيلم أيضا مع ½ CMI لمستخلصات البيتانول لنوعي الحناء، بينما لم تأثر ½ CMI لمستخلص أسيتات الإثيل على تشكيل البيوفيلم عند جميع عزلات P. aeruginosaولم تظهر مستخلصات P. persica أي انخفاض في كمية البيوفيلم وعلى العكس من ذلك تسببت في زيادة كمية تشكيلها. بينت نتائج تحليل لمستخلصات أسيتات الإثيل والبيتانول لنوعي الحناء inermis L.و P. persica بواسطة كروماتوغرافيا السائل ذو الأداء العالي (HPLC)تنوعا في التركيب. وهذا ما قد يفسر الاختلاف الملحوظ في النشاط المضاد للميكروبات وتكوين البيوفيلم بواسطة سلالات P. aeruginosa. أدت إضافة حمض السليسليك (AS) إلى تثبيط P. aeruginosa. حيث قدر CMIو CMB بحوالي Mm10 و mM20 على التوالي. وانخفض تشكيل البيوفيلم وإنتاج البيوسيانين أيضا بزيادة تراكيز حمض السليسليك. سلالة واحدة فقط (P2) كانت منتجة للرمنولبيدات في وسط PGASP وتوقف هذا الإنتاج تماما عند تركيز mM 2 من حمض السليسليك. أظهر تأثير AS على الحركة الاندفاعية للبكتريا P. aeruginosa انخفاضا تدريجيا لأقطار المستعمرات بزيادة تركيز حمض السليسليك. كلماتالمفتاحيةPseudomonas aeruginosa :،, Allium sativumLawsonia inermis، Prunus persica ، النشاط المضاد للبكتيريا، البيوفيلم، حمض السليسليك.

Résumé Le mode de vie en biofilm fournit à P. aeruginosa un environnement dense qui le protège contre les antibiotiques et le système immunitaire de l’hôte, ce qui rend le traitement de ses infections plus compliqué et nécessite de nouvelles thérapies. Dans ce cadre nous nous sommes intéressés dans ce travail à l’étude de l’activité antibactérienne et à l’effet sur la formation de biofilm des extraits obtenus de trois plantes : Allium sativum,Prunus persica et Lawsonia inermis, en utilisant six isolats cliniques de P. aeruginosa et une souche de référence de P. aeruginosa ATCC 27853.La formation de biofilm a été testée sur deux types de support et dans deux types de milieu de culture à savoir le Bouillon de Trypticase de Soja (TSB) et le Bouillon Biofilm Modifié (BBM). Nous avons constaté que la quantité de biofilm formée par P. aeruginosa dépendait de l’isolat testé, du milieu de culture utilisé et aussi de la matière du support sur lequel l’isolat s’adhère.Les résultats de cette étude indiquent que le rendement d’extraction dépend à la fois de la plante choisie et du solvant utilisé pour l’extraction où il a été constaté que l’extrait d’acétate d’éthyle de L. inermis a donné les teneurs les plus élevées, avec des valeurs ; en polyphénols de 224,83±20,07 mg EAG/g d’extrait et 244,58±25,54 mg EAG/g d’extrait pour les feuilles de la région d’Adrar et larégion de Biskra respectivement. Les valeurs de concentration minimale inhibitrice (CMI) enregistrées par les extraits étudiés varient de 3,15 à 6,25% (v/v) pour l’extrait brut d’Ail, de 3,15mg/ml à 12,5mg/ml pour les fractions d’acétate d’éthyle et de butanol pour les deux variétés de L. inermis et de 20mg/ml à 25mg/ml pour les fractions de P. persica. En outre, la formation de biofilm a été aussi diminuée avec la ½ CMI des fractions butanoliques de deux échantillons de L. inermis testés. Alors que la ½ CMI d'acétate d'éthyle n'a pas affecté la formation des biofilmschez tous les isolats testés de P. aeruginosa. L’extrait de P. persica a montré une activité très faible et bien au contraire la concentration ½ CMI pour les deux fractions (acétate d’éthyle et butanolique) de P. persica provoque une augmentation de la quantité du biofilm formé. Les résultats d’analyse des fractions des deux variétés de L. inermis et de P. persica par HPLC montrent une variabilité de la composition. Ceci peut expliquer la différence remarquée dans l’activité antibactérienne et l’effet sur la formation du biofilm par les souches de P. aeruginosa étudiées. La présence de l’acide salicylique (AS) a conduit à une inhibition de croissance de P. aeruginosa dont les CMI et les CMB été autour de 10 mM et 20 mM respectivement. La formation des biofilms et la production de pyocyanine ont été diminuées par l’augmentation des concentrations de l’AS. Une seule souche (P2) a produit des rhamnolipides dans le milieu PPGAS, cette production a été inhibée complétement avec une concentration de 2mM de l’AS. L’effet de l’AS sur la motilité de type swarming a montré une diminution progressive des diamètres des colonies par l’augmentation de concentration de cet acide. Mots clés : Pseudomonas aeruginosa, Allium sativum, Lawsonia inermis, Prunus persica, Activité antibactérienne, Biofilm, Acide salicylique.

Abstract The biofilm lifestyle provides to P. aeruginosa a dense environment that protects it against antibiotics and host's immune system, making treatment of its infections complicated and requiring new therapies. In this present work, we investigated the antibacterial activity and the anti-biofilm effect of extracts obtained from three plants: Allium sativum, Prunus persica and Lawsonia inermis using six clinical isolates of P. aeruginosa and a reference strain P. aeruginosa ATCC 27853. The formation of biofilm was tested on two types of support and in two types of culture medium namely Soybean Trypticase Broth (STB) and Modified Biofilm Broth (MBB). We found that the amount of biofilm formed by P. aeruginosa depended on the isolate tested, on the culture medium used and also on the material of the support to which the isolate adheres. The results of this study indicate that the yield extraction depends on both the selected plant and the solvent used for extraction, where it was found that the ethyl acetate extract of L. inermis gave the highest contents, with polyphenol content values of 224.83 ± 20.07 mg EAG/g extract and 244.58 ± 25.54 mg EAG/g extract for the leaves of the Adrar region and the Biskra region respectively. The minimum inhibitory concentration (MIC) values recorded by the extracts studied range from 3.15 to 6.25% (v/v) for the crude extract of garlic, from 3.15 mg/ml to 12.5 mg/ml for the ethyl acetate and butanol fractions for the two varieties of L. inermis and from 20 mg/ml to 25 mg/ml for P. persica fractions. In addition, biofilm formation was also decreased with the ½ MIC of the butanolic fractions of the two L. inermis samples tested. While ½ MIC of ethyl acetate did not affect the formation of biofilms in all of the isolates tested of P. aeruginosa. The extract of P. persica showed no or very low activity and, on the contrary, the ½ MIC concentration for the two fractions (ethyl acetate and butanolic) of P. persica caused an increase in the amount of the biofilm formed. Fractions analysis of the two varieties of L. inermis and P. persica by HPLC show a variability in there composition. This may explain the observed deference in antibacterial activities and effects on biofilm formation of P. aeruginosa. The presence of salicylic acid (SA) resulted in inhibition of P. aeruginosa whose MICs and MBCs were around 10 mM and 20 mM respectively. The formation of biofilms and the production of pyocyanin have been reduced by increasing concentrations of SA. A single strain (P2) produced rhamnolipids in PPGAS medium, this production was inhibited completely with a concentration of 2 mM of SA. The effect of SA on swarming motility showed a gradual decrease in colony diameters by increasing the concentration of this acid. Key words:Pseudomonas aeruginosa, Allium sativum, Lawsonia inermis, Prunus persica, Antibacterial activity, Biofilm, Salicylic acid.