DSpace Repository

Keratinolytic protease genes in Bacillus pumilus strain C4 - Enhancement of extracellular protease production and molecular screening.

Show simple item record

dc.contributor.author FELLAHI, SOLTANA
dc.date.accessioned 2018-07-15T08:21:32Z
dc.date.available 2018-07-15T08:21:32Z
dc.date.issued 2018-06-27
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/123456789/696
dc.description.abstract L’optimisation de la production de la protéase extracellulaire par la soucheBacillussp. C4 a été réalisée en utilisant une stratégie à deux étapes; une approche à une variable à la fois (OVAT). Basant sur les résultats d’OVAT, le milieu 1XSG additionné d'extrait de levure à 0,2% était la meilleure formule du milieu pour une production maximale de protéase par Bacillus sp. C4. Une augmentation globale de 1,8 fois la production de la protéase extracellulaire par Bacillus sp. C4 a été obtenue dans le milieu optimisé par rapport à celui non optimisé. Il a été également découvert que dans les conditions optimales, la production de protéase extracellulaire a commencé quatre heures (04 heures) plus tôt que celle produite dans les conditions non optimisées. Le gène de la protéase kératinolytique (gène ker1) a été isolé à partir de Bacillus sp. C4; une souche protéolytique possédant une activité kératinolytique; en utilisant l’amplification par PCR et des amorces spécifiques. Le gène Ker1 se compose d'un cadre de lecture ouvert de 1, 152 bps, codant pour un polypeptide constitué de 383 résidus d'acides aminés. L'analyse par BLASTP a montré que la séquence d'acides aminés déduite du gène ker1 a une similarité avec de nombreuses serine protéases provenant de différents Bacillus pumilus. Ceci indique que le gène ker1code pour l'une des serine protéases de Bacillus sp. C4. Les trois résidus présents dans toutes les subtilisines au site actif formant la triade catalytique (Asp-140, His-172 et Ser-329) ont été conservés dans la séquence d'acides aminés déduite du gène ker1. Le gène ker1est ensuite déposédans la banque de données internationale GenBank à NCBI (numéro d'accession: KX184831). Le séquençage et l'analyse du génome de Bacillus sp. C4 a été réalisée comme une approche alternative pour isoler d'autres gènes impliqués dans la dégradation de la kératine par cette souche. Le génome de Bacillus sp. C4 a été construit sous la forme d'un seul chromosome circulaire contenant 3,659,360 pb avec une teneur moyenne en GC de 41,4% et aucun plasmide n'a été détecté.Les résultats de l'annotation indiquent que Bacillus sp C4 appartient au groupe d'organismes B. pumilus. L’annotation par le NCBI prédit un total de 3 698 gènes dont 3 596 séquences codant pour protéine (CDS), 71 gènes d’ARN et 31 pseudogènes. Les gènes d'ARN prédits comprennent 60 ARNt, 10 ARNr et 1 ARN non codant (ARNnc). Le génome s'est révélé être complet à 99,6% lorsqu'il a été analysé. Le génome entier de Bacillus pumilus C4 a été déposé à la base de données GenBank sous le numéro d'accession CP011109 et le nombre de bioprojets était PRJNA278012. Quatre-vingt-un gènes candidats pour la peptidase ont été trouvés globalement dans ce génome. Six (06) gènes entre eux ont été annotés comme peptidase S8 dans laquelle deux gènes ont été prédits aussi comme subtilisines basées sur l'annotation par BASys. Le premier est le gène Ker1 (numéro d'accession: KX184831) préalablement isolé dans cette étude. Le second est un homologue du gène Ker1 et a été nommé gène Ker2. Ce gène a ensuite été soumis à NCBI GenBank (Numéro d'accession: KX184832).Le cadre de lecture ouvert de ce gène a une quantité de paires de base égale à celledugène Ker1. Les deux gènes ont une similarité de séquence de 67% en utilisant BLASTN à NCBI. La séquence d'acides aminés déduite du gène ker2 de B. pumilus C4 contenait 383 résidus d'acides aminés et les trois résidus au site actif qui forment la triade catalytique dans toutes les subtilisines sont Asp-140, His-172 et Ser-329. Les résultats de l'amplification par PCR, du séquençage de novo et de l'annotation du génome de cette bactérie indiquent que Bacillus pumilus C4possède au moins deux gènes codant pour des sérine-protéases de type subtilisine. La large spécificité du substrat et l'activité kératinolytique vis-à-vis des deux types de kératine de cette souche pourraient provenir de la présence de ce nombre élevé de peptidases et de protéases putatives. L'identification de certaines protéases produites lors de la croissance de Bacillus pumilus C4 sur le milieu optimisé a été effectuée en utilisant nLC-ESI-MS/MS suivie d'une recherche de base de données par Mascot. Les résultats de Mascot indiquent que la fraction de protéase partiellement purifiée se compose en fait de deux enzymes, correspondant aux gènes Ker1 et Ker2 précédemment identifiés de la souche de B. pumilusC4. Ceci confirme que Bacillus pumilus C4 produit au moins deux protéases qui pourraient être liées à son activité kératinilytique remarquable envers les deux types de kératines. Mots clés: Bacillus pumilus C4, protéase extracellulaire, subtilisins, kératins, le séquençage du génome entier. Optimization of extracellular protease production by Bacillus sp. C4was carried out using a two-step strategy One Variable at A Time (OVAT). On the basis of the results obtained from OVAT experiments, 1XSG medium supplemented with 0.2% yeast extract was the best medium formula for maximum protease production. An overall of 1.8-fold increase in protease production was achieved in the optimized medium as compared to the non-optimized one. The optimum predicted production conditions were as follows: beef extract (0.3%), peptone (0.5%), yeast extract (0.2%), glucose (0.1%), KCl (0.2%), FeSO4 (1mM), MgSO4 (2mM), MnCl2 (0.1mM), and CaCl2 (1 mM) and an incubation period of 24 hours. It was also found out that under the optimal conditions the extracellular protease production started four hours (04 hours) earlier than that produced in the non-optimized conditions. A keratinolytic protease gene (ker1 gene) was isolated from a keratin-degrading Bacillus sp. C4 using PCR amplification and degenerate primers. Ker1 gene consists of an open reading frame of 1,152 bps, encoding a prepropeptide (polypeptide) consists of 383 amino acidres residues. The BLASTp analysis showed that the deduced amino acid sequence of ker1 gene has identity to many serine proteases from different Bacillus pumilis. This indicated that ker1 gene encodes one of the serine protease from Bacillus sp. C4. The three residues, found in all subtilisins, at the active site that form the catalytic triad (Asp-140, His-172 and Ser-329) were conserved in the deduced protein sequence of the ker1 gene. The ker1 gene was subsequently submitted to the NCBI GenBank (accession number: KX184831). Genome sequencing and analysis of the Bacillus sp. C4 was performed as an alternative approach to investigate further keratinase genes involved in keratin degradation. Bacillus sp. C4 genome was constructed as a single circular chromosome containing 3,659,360 bps with an average G+C content of 41.4% and no plasmids were detected. Annotation results indicated that Bacillus sp C4 belongs to the B. pumilus group of organisms. NCBI Prokaryotic genome annotation pipeline predicted a total of 3,698 genes, from which 3,596 protein-coding sequences (CDS), 71 RNA genes and 31 pseudogenes. The RNA coding genes predicted include 60 tRNAs, 10 rRNAs, and 1 non-coding RNA (ncRNA). The genome was found to be 99.6 % complete when analyzed. This whole-genome Bacillus pumilus C4 sequence has been deposited at NCBI GenBank under the accession number CP011109. The bioproject number was PRJNA278012. Eighty one candidate genes for peptidase were found overall in the draft genome. Out of them six (06) genes were annotated as putative peptidase S8 in which two genes were predicted also as subtilisins based on BASys annotation. The first one is the Ker1 gene (accession number: KX184831) previously isolated in this study. The second one is a homolog to Ker1 gene and was named Ker2 gene. This gene was subsequently submitted to NCBI GenBank (Accession Number: KX184832). The ORF of this gene has an equal amount of base pairs as Ker1 gene. The two genes had a gene sequence similarity of 67% using BLASTn at NCBI. The deduced amino acid sequence of ker2 gene of B. pumilus C4 contained 383 amino acid residues and the three residues at the active site that form the catalytic triad in all subtilisins are Asp-140, His-172 and Ser-329. Results of PCR amplification, de novo sequencing, and genome annotation indicated that the protease producer and keratin degrading Bacillus pumilus C4 has at least two genes encoding subtilisin-like serine proteases. The broad substrate specificity and keratinolytic activity towards both type of keratin of this strain could originate from the presence of this high number of putative peptidases and proteases. Identification of some protease enzymes produced upon growing Bacillus pumilus C4 on optimized medium was done using nLC-ESI-MS/MS followed by Mascot database search. Mascot Search results indicated that the partial purified protease fraction in fact consists of two enzymes, corresponding to the previously identified genes Ker1 and Ker2 of the B. pumilus strain C4. This confirmed that Bacillus pumilus C4 produced at least two protease enzymes that could be related to its remarkable keratinilytic activity towards both type of keratins. Key words: Bacillus pumilus C4, extracellular protease, subtilisins, keratins, whole genome sequencing. لتحسين إنتاج إنزيم البروتياز خارج الخلية ، تم استخدام طريقة متكونة من مرحلتين: طريقة المتغير الواحد في المرة الواحدة (OVAT). أوضحت نتائج الخطوة الأولى أن الوسط (1XSG) المزود بـ 0.2% مستخلص الخميرة كان التركيبة الجيدة لأحسن إنتاج للبروتياز بمقدار 419 وحدة/مجم بروتين بعد 24 ساعة عند درجة حرارة 37 °م والأس هيدروجيني 7.0، و بحجم لقاح قدره 2%. لقد تم تحسين إنتاج إنزيم البروتياز في هذا الوسط بمعدل قدره اكثر من مرة و نصف مقارنة بالوسط الأساسي. لقد تم ايضا ايجاد ان النشاط البروتيازى لهده السلالة البكتيرية يبدا مبكرا باربع ساعات تحت الظروف المثلى مقارنة بالظروف الاساسية للنمو. تم عزل المورثة المحللة للكيراتين (جين ker1) من Bacillus sp. C4 المكسرة للكيراتين باستخدام تفاعل البلمرة المتسلسل (PCR) وبادئات البلمرة. المورثة ker1 تتكون من اطار قراءة مفتوح يضم 1152 زوج قاعدى، المشفر لمتعدد بيبتيد يتكون من 383 حمض امينى. اظهر تحليل BLASTP لسلسلة الاحماض الامينية المستنتجة لمورثة ker1 أن لديها تشابه مع الكثير من السيرين بروتياز المنتج من عدد من سلالات Bacillus pumilus . هدا يشيرالى ان المورثة ker1 مسؤولة عن انتاج واحد من السيرين بروتياز من السلالة Bacillus sp. C4. الاحماض الامينية الثلات الموجودة فى جميع انزيمات السبتليزين فى الموقع الفعال المكون لثلاثى التحفيز (Asp-140, His-172 and Ser329) كانت محفوظة فى سلسلة الاحماض الامينية الناتجة عن المورثة ker1. تم ادراج المورثة ker1 ضمن قاعدة البيانات العالمية (NCBI)تحت رقم القبولKX184831 . تم تحديد التتابع النكليوتيدى لجينوم Bacillus sp. C4 وتحليله كطريقة بديلة للبحث عن المزيد من المورثات المسؤولة عن تحليل الكيراتين. وجد ان جينوم Bacillus sp. C4 يتكون من كروموزوم حلقى واحد مؤلف من 3,659,360 زوج قاعدى بنسبة G+C بحدود % 41.4 و لا وجود للبلازميدات. تم القيام بدراسة الناحية الوظيفية والتركيبية لمسودة تسلسل جينوم البكتيريا Bacillus sp. C4 بواسطة النظامين الاليين BASys و PGAP فى موقع NCBI. اظهرت النتائج ان السلالة Bacillus sp C4 تنتمى الى مجموعة B. pumilus. وقد استطاع نظام الكشف على المورثات التعرف على ما مجموعه 3692 مورثة منها 3596 تتابع مشفر للبروتين، 71 مورثة خاصة بـ RNA و 31 مورثة كاذبة. المورثات المتنبأ بها والمشفرة للRNA تضم 60 مورثة خاصة بـ RNA الناقل (tRNA)، 10 مورثات خاصة بـ RNA الريبزومي (rRNA) ومورثة واحدة للRNA غير معبر عنها. تم تحديد %99.6 من التتابع النكليوتيدى لجينوم Bacillus sp. C4. تم ايداع هدا الجينوم فى قاعدة البيانات GenBank تحت رقم الدخول CP011109 ورقم المشروع PRJNA278012. واحد وثمانون مورثة مرشحة لان تشفر للبيبتيداز تم ايجادها فى مسودة الجينوم. ستة من هده المورثات تم تصنيفها على انها بيبتيداز S8 مفترضة، من بينها جينين تم التنبؤ بهما كسبتليزين اعتمادا على نظام BASys. أولهما المورثة Ker1 الدى تم عزلها فى هده الدراسة (رقم الدخول: KX184831). ثانيهما هى مورثة مشابهة للمورثة Ker1 وسميت مورثة ال Ker2. هده الاخيرة تم ايداعها ضمن قاعدة البيانات GenBank تحت رقم الدخول KX184832. اطار القراءة المفتوح لمورثة Ker2 لها نفس العدد من القواعد للمورثة Ker1. باستعمال BLASTN على موقع NCBI، وجد ان لهاتين المورثتين 67% نسبة تشابه. سلسلة الاحماض الامينية المستنتجة للمورثة Ker2 وجد انها تتكون من 383 حمض أمينى والثلاث أحماض امينية المكونة لثلاثى التحفيز فى الموقع الفعال المميزة لجميع انزيمات السبتليزين كانت كالتالى: Asp-140، His-172 و Ser-329. أظهرت نتائج كل من تفاعل البلمرة المتسلسل، تحديد التتابع النكليوتيدى من جديد واضافة الوظائف لجينات الجينوم ان Bacillus pumilus C4 المنتجة للبروتياز والمحللة للكيراتين تحتوى على الاقل على مورثتين مشفرتان للسيرين بروتياز مثل السبتليزين. المجال الواسع لهده البكتيريا تجاه عدة ركائز وقدرتها على تحليل كلا النوعين من الكيراتين الفا وبيتا يمكن ارجاعه الى هدا العدد الكبير من المورثات المشفرة لانزيمات البروتياز والبيبتيداز المفترضة. تم التعرف على بعض انزيمات البروتياز المنتجة من طرف Bacillus pumilus C4 و المنماة على وسط الانتاج بواسطة تقنية كروماتوغرافيا السائلة – التاين بالرداد الالكترونى- قياس الطيف الكتلى المترادف nLC-ESI-MS/MS المتبوعة بالبحث فى قاعدة البيانلت باستعمال Mascot. اشارت نتائج البحث باستخدام Mascot ان عينة الانزيم المنقى جزئيا فى الحقيقة تتكون من انزيمين موافقين للجينين Ker1 و Ker2 السابق عزلهما. هدا يؤكد مرة اخرى ان Bacillus pumilus C4 تنتج على الاقل انزيمين من البروتياز والدى من الممكن ان يكون لهما علاقة بقدرتها على كسر نوعى الكيراتين. الكلمات المفتاحية: Bacillus pumilus C4، بروتياز خارج خلوي، سبتليزين، كيراتين، قراءة التتابع النيكليوتيدى للجينوم،. en_US
dc.language.iso en en_US
dc.publisher Fellahi et al. AMB Expr (2016) 6:42 DOI 10.1186/s13568-016-0213-0 ORIGINAL ARTICLE Identification of two new keratinolytic proteases from a Bacillus pumilus strain using protein analysis and gene sequencing Soltana Fellahi1,2, Abdelwaheb Chibani1, Elisabeth Feuk‑Lagerstedt2* and Mohammad J. Taherzadeh2 en_US
dc.subject Bacillus pumilus C4, protéase extracellulaire, subtilisins, kératins, le séquençage du génome entier..-Bacillus pumilus C4, extracellular protease, subtilisins, keratins, whole genome sequencing..-الكلمات المفتاحية: Bacillus pumilus C4، بروتياز خارج خلوي، سبتليزين، كيراتين، قراءة التتابع النيكليوتيدى للجينوم،. en_US
dc.title Keratinolytic protease genes in Bacillus pumilus strain C4 - Enhancement of extracellular protease production and molecular screening. en_US
dc.type Thesis en_US


Files in this item

This item appears in the following Collection(s)

Show simple item record

Search DSpace


Browse

My Account