Etude de l’effet antimicrobien et antioxydant des métabolites secondaires secrétés par des Pseudomonas originaires desconditions extrêmes

Abstract

الملخص إِ نَّ اَّلأمراض اَّلمتكررة فَّي اَّلعالم وَّ خَّاصة فَّي اَّلجزائر هَّي اَّلأمراض اَّلمعدية اَّلتي يَّعودَّ ظهورها إَّلى سَّلالات مَّيكروبية مَّقاومة لَّلمضادات اَّلحيوية. مَّن أَّجل اَّلمساهمة فَّي حَّل هَّذهَّ المشكلة عَّن طَّريق اَّلبحث عَّن مَّركبات مَّضادة لَّلميكروبات، حَّاولنا دَّراسة اَّلخصائصَّ التي Pseudomonas spَّ البيولوجية لَّبعض مَّواد اَّلأيض اَّلثانوية اَّلتي تَّفرزها سَّلالات مَّترممة لََّّ مَّن ثَّلاث عَّينات مَّن تَّربةَّ Pseudomonasَّ يعود مَّصدرها إَّلى التربة اَّلمالحة. تَّم جَّمع 57ََّّ عَّزلة سهل مَّينا )َّغليزان - اَّلجزائر(، أَّختيرت هَّذه اَّلعزلات لَّمعرفة خَّصائص اَّلتضاد لَّديها .َّ إن تَّحديدَّ عشرين عَّزلة ذَّات قَّدرة عَّالية عَّلى اَّلتضاد بَّاستخدام اَّلنمط اَّلمظهري، اَّلجزيئي وَّ بَّاستخدامَّ ،َََََََََّّّّّّّّّ P. aeruginosa سَّمح بَّتجميع اََّّلعزلات إَّلى أَّربعة أَّنواع مَّختلفة، هَّي MALDI-TOF تَّم اَّستخلاص مَّركبات اَّلفينازين وَّالبيوسيانينَّ .P. fragi و P. putidaَّ ، P. fluorescens والبيوفيردين مَّن هَّذه اَّلعزلات بَّمذيبات مَّختلفة وَّ تَّم تَّحديد خَّصائصها بََّّالطرق اَّلتحليليةَّ كَّروماتوغرافيا اَّلسائل ذَّو اَّلأداءَّ HPLCَّ ، المختلفة وَّهي كَّروماتوغرافيا اَّلطبقة اَّلرقيقة، اَّلطيف اَّلنتائج اَّلتي تَّم اَّلحصول عَّليها تَّكشف عَّن اَّلتطابق مَّع اَّلمواد اَّلمطلوبة بَّدرجةَّ .FTIRَّ العالي وَّ نقاوة تَّختلف مَّن مَّادة إَّلى أَّخرى. ب يَّن تَّقييم اَّلنشاط اَّلمضاد لَّلميكروبات فَّي اَّلزجاج أََّّن مَّركباتَّ الفينازين وَّ اَّلبيوسيانين تَّثبط نَّمو غَّالبية اَّلسلالات اَّلممرضة اَّلمدروسة، عَّلى عَّكس مَّستخلصَّ البيوفيردين اَّلذي أَّظهر تَّأثيرا ضَّئيلا. فَّي مَّوازاة ذَّلك، فَّإن دَّراسة اَّلنشاط اَّلمضاد لَّلأكسدةَّ وتحلل اَّلدم بَّمركبات اَّلفينازين وََّّالبيوسيانين تَّبين أَّن هَّاتين اَّلمادتين تَّملكان نَّشاطا مَّلحوظاَّ مضادا لَّلأكسدة مَّقارنة بَّحمض اَّلاسكوربيك اَّلمستخدم فَّي حَّين لَّم يَّتم اَّلكشف عَّن أَّي تَّحلل لَّلدمَّ في اَّلتراكيز اَّلأقل مَّن 01َّ مَّلغ /َّ مَّل مَّن كَّلا اَّلمادتين. أظهرت نَّتائج تَّأثير اَّلملوحة وَّدرجةَّ عَّلى إَّنتاج اَّلبيوسيانين وَّالبيوفيردين أَّن اَّلعزلة اَّلمختبرة تَّفرزَّ pHَّ الحرارة وَّ اَّلأس اَّلهدروجيني 51.21 ) في وَّسط يَّحتوي عَّلى 0.27َّ غَّ /َّ لَّ مَّن كَّلوريدَّ μg/ml)َّ الحد اَّلأقصى مَّن اَّلبيوسيانين 5. وَّتشير اَّلنتائج أَّيضا إَّلى أَّن أَّقصى قَّدرَّ pH الصوديوم عَّند دَّرجة حَّرارة اَّلتحضين 01َّ °م و 5 وَّينخفض هَّذا اَّلإنتاجَّ pHَّ من اَّلبيوفيردين يَّتم إَّنتاجه عَّند دَّرجة حَّرارة 2َّ. دَّرجة مَّئوية وَّعند مع زَّيادة تَّراكيز كَّلوريد اَّلصوديوم. إن اَّلكشف عَّن اَّلجينات اَّلمتعلقة بَّكربوكسيل اَّلفينازينَّ والمضادات اَّلحيوية اَّلأخرى )َّبيولوتورين، بَّيرولنيترين، 4َّ,.-دياستيلفلوروغلوسينول( فَّيَّ اَّلمنتخبة أَّظهرت وَّجود اَّلجينات اَّلمسؤولة عَّن إَّنتاجها بَّاستثناء اَّلجينَّ Pseudomonasَّ عزلات المشفر لََّّلبيولوتورين، اَّلذي لَّم يَّظهر فَّي جَّينوم اَّلعزلات اَّلمدروسة .َّ نَّشاط مَّضادات اَّلميكروبات؛ مَّضادات اَّلأكسدة؛ اَّلكشفَّ ؛Pseudomonasَّ : الكلمات المفتاحية عن اَّلجينات؛ تَّحديد اَّلخصائص ؛َّ اَّلمكروبات اَّلممرضة .َّ Résumé Les maladies récurrentes dans le monde et particulièrement en Algérie sont des maladies infectieuses qui sont dues à des souches microbiennes résistantes aux antibiotiques. Afin de contribuer dans la résolution de ce problème via la recherche des substances antimicrobiennes, nous avons essayé d’examiner les propriétés biologiques de quelques métabolites secondaires, sécrétées par des souches saprophytes de Pseudomonas sp originaire des sols salins. Au total, 75 isolats de Pseudomonas collectés à partir de 3 échantillons de sols issus de la plaine de Mina (Relizane-Algérie) ont fait l’objet d’une évaluation de leurs propriétés antagonistes. L'identification de vingt isolats à pouvoir antagoniste élevé, par une approche polyphasique : phénotypiques, moléculaires et par MALDI-TOF a permis de rassembler les isolats en quatre espèces différentes à savoir P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida et P. fragi. Les phénazines, la pyocyanine et la pyoverdine ont été extrait à partir des isolats antagonistes par différents solvants ensuite caractérisés par les différentes méthodes analytiques à savoir : CCM, spectrophotométrie, HPLC et FTIR. Les résultats obtenus révèlent une similitude avec les substances recherchées avec un degré de pureté qui diffère d’une substance à une autre. L’évaluation de l’activité antimicrobienne in vitro montre que les phénazines et la pyocyanine inhibent la croissance de la majorité des souches pathogènes testées, contrairement à l’extrait de la pyoverdine qui présente un effet négligeable. En parallèle l’étude de l’activité antioxydante et hémolytique des phénazines et la pyocyanine montrent que ces deux substances présentent une activité antioxydante remarquable par rapport à l’acide ascorbique utilisé, par contre aucune hémolyse n’a été détectée à des concentrations inférieures au 10 mg/ml des deux substances. Les résultats de l’effet de la salinité, de la température et du pH sur la production de la pyocyanine et de la pyoverdine montrent que l’isolat testé a sécrété un maximum de pyocyanine (51.21 μg/ml) dans un milieu contenant 12.5 g/l de NaCl à une température d’incubation de 30 °C et à pH 7. Les résultats indiquent aussi que la quantité maximale de pyoverdine est produite à une température de 28 °C et à pH 7 et diminue avec l’augmentation des concentrations du NaCl. La détection des gènes relatifs à la phénazine carboxylate et aux autres antibiotiques (la pyoluteorine, la pyrrolnitrin, la 2,4-Diacetylphloroglucinol) chez les isolats de Pseudomonas sélectionnés ; révèle la présence des gènes responsables à leurs production à l’exception du gène codant pour la pyoluteorine qui est absent dans le génome des isolats testés. Mots clés : Pseudomonas ; activité antimicrobienne ; activité antioxydante ; détection des gènes ; caractérisation ; souches pathogènes. Abstract The recurrent diseases in the world and particularly in Algeria are infectious diseases that are due to antibiotic-resistant microbial strains. In order to contribute to the resolution of this problem in the search for antimicrobial substance, we tried to examine the biological properties of some secondary metabolites secreted by saprophytic strains of Pseudomonas originating from saline soils. A total of 75 Pseudomonas isolates obtained from three soil samples from the Mina Plain (Relizane -Algeria) were evaluated for their antagonistic properties. The identification of twenty isolates with high antagonist power, using a polyphasic approach: phenotypic, molecular and by MALDI-TOF, allowed the isolates to be grouped into four different species, namely P. aeruginosa, P. fluorescens, P. putida and P. fragi. The phenazines, Pyocyanin and pyoverdine were extracted from the antagonist isolates by different solvents then characterized by the various analytical methods, namely TLC, spectrophotometry, HPLC and FTIR. The obtained results reveal a similarity with the desired substances with a degree of purity which differs from one substance to another. The evaluation of the antimicrobial activity in vitro shows that the phenazines and pyocyanine inhibit the growth of the majority of the pathogenic strains tested, unlike the pyoverdine extract which has a negligible effect. In parallel, the study of the antioxidant and hemolytic activity of phenazines and pyocyanin show that these two substances exhibit a remarkable antioxidant activity compared to the ascorbic acid used, whereas no haemolysis was detected at concentrations lower than 10 mg / ml of both substances. The results of the effect of salinity, temperature and pH on the production of pyocyanin and pyoverdin show that the isolate tested secreted a maximum of pyocyanin (51.21 μg / ml) in a medium containing 12.5 g / L of NaCl at an incubation temperature of 30 °C and pH 7. The results also indicate that the maximum amount of pyoverdin is produced at a temperature of 28 °C and at pH 7 and decreases with increasing concentrations of NaCl. The detection of genes related to phenazine carboxylate and other antibiotics (pyoluteorin, pyrrolnitrin, 2,4- Diacetylphloroglucinol) in selected Pseudomonas isolates; reveal the presence of the genes responsible for their production with the exception of the gene encoding pyoluteorin which is absent in the genome of the isolates tested. Key words: Pseudomonas; antimicrobial activity; antioxidant activity; detection of genes; characterization; pathogens